在復(fù)雜的腸道微生物群落中，細菌種群之間的競爭決定著生態(tài)位的穩(wěn)定與優(yōu)勢。Ⅵ型分泌系統(tǒng)（Type VI secretion system, T6SS）是革蘭氏陰性菌中一種普遍存在的分泌裝置，能夠以接觸依賴的方式將毒性效應(yīng)蛋白注入競爭菌體，從而實現(xiàn)“同類廝殺”與生態(tài)主導(dǎo)。盡管已有研究揭示T6SS可裝載多種類型的效應(yīng)分子，但這些效應(yīng)蛋白在同一次分泌事件中是否可以被協(xié)同裝載、如何識別與釋放、又如何實現(xiàn)功能協(xié)同，長期以來一直未有清晰的分子機制。本研究以人腸道共生菌 Bacteroides fragilis GS086 為模型，揭示了兩種效應(yīng)蛋白BtpeA與BtaeB在一個新的適配蛋白BtapC的協(xié)調(diào)下被協(xié)同分泌的完整過程，解析了四元復(fù)合物VgrG–BtpeA–BtaeB–BtapC的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并闡明了其在腸道菌群競爭中的功能意義。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了Bacteroidota門細菌T6SS系統(tǒng)的特殊演化模式，也為理解多效應(yīng)蛋白共分泌提供了新的理論框架。

B. fragilis GS086中T6SS V2 基因座攜帶兩種對種間競爭關(guān)鍵的效應(yīng)因子

        研究首先通過對B. fragilis GS086中T6SS V2位點的基因組比對發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含兩個潛在效應(yīng)基因btpeA與btaeB，以及一個未注釋的基因btapC。野生型菌株在與受體菌Bacteroides xylanisolvens共培養(yǎng)時表現(xiàn)出強烈的殺傷作用，而刪除btpeA、btaeB或btapC中的任意一個基因后，殺傷作用完全喪失，與T6SS失活突變株相似。這一現(xiàn)象表明，三者之間存在功能依賴關(guān)系。進一步的免疫印跡實驗顯示，BtpeA與BtaeB的分泌均依賴T6SS核心成分Hcp，且在受體菌周質(zhì)中過表達會導(dǎo)致明顯的細胞腫脹與裂解現(xiàn)象。相關(guān)檢測均使用了AtaGenix提供的兔多克隆抗體（anti-BtpeA、anti-BtaeB、anti-BtapC、anti-Hcp1），通過 Western 免疫印跡實驗，以胞質(zhì)蛋白 DnaK為內(nèi)參對照，清晰區(qū)分了全細胞裂解液與培養(yǎng)上清中目標蛋白的分布，準確驗證了 BtpeA、BtaeB 的 T6SS 依賴性分泌特性。

Figure 1. 兩個相鄰的T6SS效應(yīng)物位點檢測

BtpeA與BtaeB為功能不同但均能破壞細胞壁的酶

        結(jié)構(gòu)和生化分析進一步揭示了兩種效應(yīng)蛋白的功能特征。BtpeA含有一個PAAR結(jié)構(gòu)域和兩個未注釋功能域，其C端D3結(jié)構(gòu)域與大腸桿菌ColM磷酸酶高度同源，可催化細胞壁前體分子Lipid II的去磷酸化反應(yīng)，從而阻斷肽聚糖的合成。BtaeB則包含一個N端結(jié)構(gòu)域和一個屬于C39家族的C端酰胺酶結(jié)構(gòu)域，通過Cys460和His546活性位點切割肽聚糖四肽交聯(lián)，直接破壞細胞壁。兩者分別從細胞壁合成與降解兩端發(fā)起攻擊，形成互補的破壞模式。作者還發(fā)現(xiàn)BtpeA和BtaeB的分泌呈現(xiàn)顯著的互相依賴性：當(dāng)刪除其中一個效應(yīng)基因時，另一種蛋白的分泌完全被抑制，而細胞內(nèi)表達水平并未受到影響。這種互依關(guān)系提示它們可能被作為一個整體加載到T6SS的VgrG裝置上。

Figure 2. 細胞壁破壞性T6SS效應(yīng)物對物種間競爭至關(guān)重要

BtpeA與BtaeB的T6SS介導(dǎo)分泌具有相互依賴性

        為了尋找支撐這一協(xié)同分泌現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)，研究者重點關(guān)注了位于同一基因簇中的BtapC。刪除btapC不僅使BtpeA與BtaeB的分泌消失，也導(dǎo)致Hcp釋放減少，表明BtapC在整個T6SS系統(tǒng)的裝配中發(fā)揮核心作用。隨后通過Pull-down與免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，BtapC可直接與BtpeA結(jié)合形成二元復(fù)合物，而BtaeB則只能在該二元復(fù)合物形成后再被招募，從而生成三元復(fù)合物BtpeA–BtaeB–BtapC。進一步的實驗顯示，這個三元復(fù)合物能夠與VgrG結(jié)合形成穩(wěn)定的四元裝載復(fù)合體VgrG–BtpeA–BtaeB–BtapC。該結(jié)果在體內(nèi)外均得到驗證，充分證明了BtapC作為“裝載適配器”的關(guān)鍵作用。實驗中，AtaGenix 的 anti BtapC 抗體 成功檢測到 BtapC 在復(fù)合物中的存在，結(jié)合 anti BtpeA、anti BtaeB、anti VgrG 抗體，明確了 BtapC 在復(fù)合物組裝中的銜接作用。

Figure 3. 三元復(fù)合物的形成由BtapC協(xié)調(diào)，并隨后裝載到VgrG上

VgrG-BtpeA-BtaeB-BtapC 四元復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)與組裝機制

        單顆粒冷凍電鏡對該四元復(fù)合物進行了高分辨率解析，分辨率達到3.06 Å，揭示了復(fù)雜而精密的分子裝配方式。BtapC呈現(xiàn)出開放貝殼狀構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)空腔緊密包裹著BtpeA的N端α1–α4螺旋，并通過大量疏水與極性相互作用穩(wěn)定結(jié)合。這一結(jié)構(gòu)不僅奠定了BtpeA與BtapC的結(jié)合界面，也為后續(xù)BtaeB的裝載提供空間基礎(chǔ)。BtaeB在與BtpeA–BtapC復(fù)合物結(jié)合后，其β12片段發(fā)生顯著構(gòu)象變化，使Lys188側(cè)鏈可同時與BtpeA的Asp148及BtapC的Ser127形成氫鍵橋，從而在三者之間建立穩(wěn)定的連接網(wǎng)絡(luò)。點突變實驗驗證了這一關(guān)鍵氨基酸殘基對復(fù)合物形成的重要性。值得注意的是，在該復(fù)合物中，BtpeA的PAAR結(jié)構(gòu)域通過VgrG尖端完成裝載，而BtaeB的存在是維持該過程穩(wěn)定進行的必要條件。AtaGenix 的 anti BtpeA、anti BtapC 抗體 在此過程中準確識別不同截短體蛋白，為結(jié)構(gòu) - 功能關(guān)系驗證提供了特異性檢測工具。

Figure 4. VgrG-BtpA-BtaeB-BtapC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

BtaeB 的保守環(huán)結(jié)構(gòu)對 BtpeA 與 BtaeB 共分泌至關(guān)重要

        在進一步的結(jié)構(gòu)分析中，作者在BtaeB的C端發(fā)現(xiàn)了一段獨特的短環(huán)（殘基400–407），其電子密度位于VgrG與BtpeA PAAR界面的結(jié)合面上。這一環(huán)狀結(jié)構(gòu)嵌入VgrG–BtpeA之間的三角區(qū)域，形成多重氫鍵與疏水作用，起到穩(wěn)定復(fù)合體的“鎖鍵”作用。功能驗證表明，保留該環(huán)的BtaeB突變株能夠正常分泌BtpeA與Hcp，而刪除該環(huán)則完全喪失分泌能力。由此可以確定，這段短環(huán)是驅(qū)動雙效應(yīng)蛋白協(xié)同裝載的結(jié)構(gòu)檢查點（checkpoint），確保兩種效應(yīng)分子在每次T6SS發(fā)射事件中被同步注入受體菌。

Figure 5. BtaeB衍生的環(huán)對BtpeA和BtaeB的共分泌至關(guān)重要

共分泌的 BtpeA 與 BtaeB 協(xié)同提升脆弱擬桿菌的腸道適應(yīng)性

        動物實驗進一步驗證了這種協(xié)同分泌在生態(tài)競爭中的生理意義。研究者將野生型及不同突變株分別與敏感菌株共定植于抗生素處理后的無菌小鼠腸道中。結(jié)果顯示，單獨失活BtpeA的菌株對受體的競爭力下降約10³倍，而單獨失活BtaeB或完全缺失T6SS的菌株幾乎喪失競爭能力。相比之下，野生型菌株能將受體菌豐度降低約10?倍，說明BtpeA與BtaeB在腸道環(huán)境中表現(xiàn)出顯著的協(xié)同毒性。也就是說，BtpeA阻斷細胞壁修復(fù)，而BtaeB直接切割肽聚糖交聯(lián)，兩者聯(lián)合造成不可逆的細胞壁崩解，從而賦予菌株更強的腸道定殖優(yōu)勢。生物信息學(xué)分析顯示，這種BtapC介導(dǎo)的雙效應(yīng)蛋白共分泌機制在Bacteroidota門中普遍存在，約50%的B. fragilis菌株攜帶類似的結(jié)構(gòu)模塊，提示該系統(tǒng)在腸道細菌進化中具有高度保守性與適應(yīng)性。

Figure 6. BtapC介導(dǎo)的效應(yīng)物共分泌在小鼠中產(chǎn)生功能協(xié)同作用，并且很可能在人類腸道擬桿菌門中得到保留

        總體來看，該研究首次系統(tǒng)性地揭示了腸道共生菌中一種獨特的T6SS協(xié)同分泌模式：BtapC作為核心適配器，通過與BtpeA形成初級復(fù)合物并依次招募BtaeB，使兩種結(jié)構(gòu)與功能互補的效應(yīng)蛋白能夠在同一次T6SS發(fā)射中共同被注入競爭菌體。BtaeB末端短環(huán)插入VgrG–BtpeA結(jié)合界面，形成裝載“鎖鍵”，確保整個四元復(fù)合物的穩(wěn)定裝配與同步分泌。這一機制不僅實現(xiàn)了結(jié)構(gòu)層面的多效應(yīng)協(xié)同，還通過功能互補顯著增強了菌株在腸道生態(tài)中的競爭力。更值得注意的是，這一發(fā)現(xiàn)揭示了T6SS可能具備“模塊化裝配”的潛力，即通過保守的裝載骨架結(jié)合可變的毒性模塊，實現(xiàn)對不同環(huán)境的定向適應(yīng)。借助AtaGenix提供的多克隆抗體體系（anti-BtpeA、anti-BtaeB、anti-BtapC、anti-Hcp1），研究者得以精準追蹤復(fù)合物的形成與分泌過程，為T6SS結(jié)構(gòu)與功能研究提供了強有力的工具支持。未來，類似的裝載策略或可被人工改造，用于開發(fā)針對特定腸道菌群的微生態(tài)干預(yù)技術(shù)，甚至為抗耐藥細菌的新型精準殺菌系統(tǒng)提供設(shè)計模板。

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