客戶背景
桔梗（Platycodon grandiflorus）是一種廣泛應用于抗炎、抗腫瘤和認知增強的藥用植物，其生物活性主要來源于三萜皂苷，如桔梗皂苷D（PD）和桔梗皂苷D3（PD3）。安徽中醫(yī)藥大學研究團隊在《International Journal of Molecular Sciences》發(fā)表的研究（DOI：10.3390/ijms26104832）鑒定出桔梗中107個UDP-糖基轉移酶（UGT）基因，其中PgUGT29催化PD向PD3的糖基化反應，這是皂苷生物合成的關鍵步驟。該研究為藥用植物活性化合物的代謝工程提供了基礎。

客戶需求
研究需要在大腸桿菌中異源表達并純化PgUGT29和PgUGT72蛋白，以驗證其酶活性，同時開發(fā)特異性抗體，研究蛋白相互作用并確認PD在C3位的糖基化活性，為闡明皂苷生物合成途徑提供支持。

技術挑戰(zhàn)
1. 蛋白表達與純化：植物來源的UGT蛋白（如PgUGT29和PgUGT72）在大腸桿菌中常表現(xiàn)為低溶解性和錯誤折疊，需優(yōu)化表達條件和重折疊策略，以實現(xiàn)高純度（>95%）和功能活性。
2. 抗體特異性：開發(fā)針對PgUGT29的抗體需設計特異性表位抗原，確保高特異性和低交叉反應性，這對Western blot和免疫熒光等復雜實驗的準確檢測至關重要。
3. 功能驗證：確保重組UGT蛋白在體外實驗（如HPLC糖基化實驗）中保持酶活性，并保證抗體在分子研究中精確檢測目標蛋白，需要嚴格的質量控制和驗證。

技術服務解決方案
普健生物為桔梗UGT研究提供定制蛋白表達和抗體開發(fā)服務：
1. 重組PgUGT表達與純化：
(1) 使用IPTG誘導（1 mM，37°C，4小時）在大腸桿菌BL21（DE3）中表達His標簽的PgUGT29和PgUGT72，通過Ni-NTA親和層析和尿素透析重折疊，獲得純度>95%、濃度為0.21–0.50 mg/mL的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗證。
(2) 采用Bradford法量化蛋白，滿足HPLC酶活性測試需求。
2. 抗PgUGT29抗體定制與驗證：
(1) 設計針對PgUGT29特異性表位（例如PSPG基序區(qū)域）的抗原，生產(chǎn)兔源多克隆抗體，通過Western blot和免疫熒光驗證其特異性，確保在植物組織中準確檢測PgUGT29。
(2) 在4–6周內交付抗體，符合項目時間要求。
3. 功能驗證支持：
(1) 提供基于HPLC的酶活性實驗，確認PgUGT29以UDP-Glc為供體催化PD向PD3的轉化，采用PgUGT72作為陰性對照以確保特異性。
(2) 支持分子對接研究，識別UDP-Glc結合的關鍵殘基（如T145、D392、Q393、N396），加深對酶-底物相互作用的理解。

我們的蛋白表達和抗體定制服務成功實現(xiàn)了PgUGT29和PgUGT72的表達與純化，HPLC驗證確認PgUGT29催化PD向PD3的轉化?？筆gUGT29抗體展現(xiàn)出高特異性，精準檢測目標蛋白，支持了功能研究的順利開展。這些成果為闡明桔梗皂苷生物合成途徑提供了重要支持，推動了藥用皂苷（如PD3）在藥物開發(fā)中的代謝工程應用，顯著提高了其潛在產(chǎn)量。

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