內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖，主要由類脂A、0-特異性多糖側鏈和核心寡聚糖三部分組成。

內毒素的生物學功能：

1、致熱性

2、對細菌細胞外膜有保護作用

3、誘導白細胞粘連分子粘連到內皮細胞上

4、刺激中性粒細胞，誘導其形態(tài)發(fā)生改變

5、促發(fā)凝血系統，導致彌散性血管內凝血

6、導致器官損傷，中毒性休克

7、誘導細胞凋亡

8、具有免疫佐劑活性

9、激活補體，發(fā)揮天然的免疫應答效應

 

內毒素的檢測方法

 

鱟試劑法 

具有快速、簡便、靈敏度高和重復性好等優(yōu)點，是目前檢測內毒素的金標準。但這種方法有兩大缺陷，檢測結果易受樣品本身的顏色及濁度影響，必須對樣品進行前處理；需要捕殺大量保護動物鱟。因此，鱟試劑法的替代方法備受關注，如：羅氏蛋白染色法、焚光偏振法、同位素標記法、ELISA等，其中ELISA應用較為廣泛。

 

ELISA 

具有特異性好、準確性高等優(yōu)點，可以直接檢測含高濃度內毒素（如發(fā)熱病人血清）的樣本，但其檢測靈敏度較當試劑法有較大差距，對于環(huán)境中的低濃度內毒素，往往需要進行樣品預處理后才能檢測。此外，使用的內毒素抗體產品劑量少、成本高，對溫度、有機溶劑耐受性差，極大的限制了ELISA在環(huán)境樣品內毒素檢測中的應用。

 

利用分子印跡技術所制備的人工抗體（MIP），可特異性識別和結合IE分子，并具有穩(wěn)定性好、能耐受高溫高壓和強酸強堿等特點，已廣泛用于固相萃取、親和層析等樣品預處理和分析技術中。將MIP與ELISA技術相結合，可以充分發(fā)揮MIP的特異性吸附作用，高效分離和富集樣品中殘留的內毒素，同時在ELISA中引入發(fā)光物質進行檢測，以提高內毒素檢測的靈敏度和準確性。

 

內毒素的去除

 

內毒素分子結構復雜且不均一，導致內毒素可以多種方式與溶液中的蛋白質相互作用，形成復合物，大大增加了去除的難度。

 

內毒素的去除可采用親合層析法、離子交換層析法、疏水層析法、凝膠過濾層析法、超濾法、吸附法等。

 

去除方法

 

親合層析法

 

原理：利用被分離的生命大分子物質和特異性配體之間能可逆結合與解離；從內毒素的空間排布及立體結構的特點，篩選能與其互補親和的配基

優(yōu)點：簡單快速，分離效率高，保留活性，作用力強，選擇性高

不足：必須找到與分離物質合適的配體，成本高，范圍受限

離子交換層析法

原理：內毒素在pH>2時帶負電荷，與陰離子交換介質Q或DEAE基團有較強結合，可用高鹽緩沖液或NaOH去除

優(yōu)點：適于從堿性蛋白質中去除，成本低，吸附容量大

不足：不適合于溶液中存在其他帶負電荷物質的情況

疏水層析法

原理：內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性，在高鹽下會凝集，無法掛上疏水層析柱

優(yōu)點：可選擇能結合目標蛋白的疏水介質而去除內毒素

不足：適用對象受限

凝膠過濾層析法

原理：內毒素多為多聚體，根據分子大小可以有效分離

簡單有效

不足：處理量小，耗時長

超濾法

原理：原液及保護劑的分子量與內毒素分子量差別較大，選擇合適的超濾膜

優(yōu)點：適用于目標產物分子量小的溶液

不足：活性損失大

吸附法

原理：熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去

優(yōu)點：?適合于組分較為簡單的小分子的溶液中去除

不足：易吸附有效成分，殘余活性炭不易去除