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卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)高致死率的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)和耐藥問題長期困擾臨床治療。研究表明，腫瘤干細(xì)胞（OCSLCs）是推動卵巢癌惡性進(jìn)展與復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。然而，OCSLC干性的維持機(jī)制尚不清晰。PI3K/AKT通路被認(rèn)為在干細(xì)胞特性和耐藥性中發(fā)揮核心作用，但如何在亞型水平上特異調(diào)控仍有待揭示。中國醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊發(fā)表于《ADVANCED SCIENCE》的一篇文章聚焦于蛋白精氨酸脫亞氨酶家族成員PAD1，探索其在卵巢癌干樣細(xì)胞中的作用機(jī)制。
PAD1在卵巢癌上調(diào)并驅(qū)動惡性表型與干性
研究人員首先在人卵巢癌組織與卵巢囊腫對照樣本中檢測PAD家族轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)PAD1在腫瘤中顯著上調(diào)；蛋白層面的免疫組化同樣顯示腫瘤組織 PAD1 染色更強(qiáng)，提示 PAD1與腫瘤發(fā)生相關(guān)。在 OVCAR3、SKOV3 等細(xì)胞系中以慢病毒干擾 PAD1，驗證了敲低效率，并觀察到增殖、遷移、侵襲顯著下降，以及裸鼠成瘤體積減小與IHC/WB證實的腫瘤內(nèi)PAD1下降。
Figure 1. PAD1表達(dá)與OC進(jìn)展呈正相關(guān)
進(jìn)一步針對干性，PAD1 knockdown 使 CD133、CD44、OCT4、SOX2 表達(dá)降低；球形成效率下降；極限稀釋移植（ELDA）顯示腫瘤起始細(xì)胞頻率降低；來源于患者腹水的原代腫瘤細(xì)胞在 PAD1 干擾后同樣出現(xiàn)干性標(biāo)志與成球/侵襲能力的下調(diào)。
Figure 2. PAD1增加OC細(xì)胞的腫瘤起始能力
PAD1 通過 AKT 通路維持干性，并與 AKT2 特異互作
RNA-seq與富集分析顯示PAD1干擾后，差異基因集中富集于PI3K-AKT信號，藥理抑制 PI3K/AKT（LY294002）可劑量依賴性下調(diào)干性標(biāo)志。WB 顯示 PAD1 敲低抑制 AKT 的關(guān)鍵活化位點磷酸化，而CD133? 高PAD1 亞群具有更高AKT磷酸化水平；在CD133? 細(xì)胞中敲低 PAD1可顯著抑制AKT磷酸化。機(jī)制上，免疫共沉淀與質(zhì)譜表明PAD1與AKT2形成復(fù)合體；截短體互作與GST pull-down指向AKT2激酶結(jié)構(gòu)域為結(jié)合界面；對接計算亦支持二者高親和界面。
Figure 3. PAD1通過激活A(yù)KT信號通路維持OCSLC的干性
PAD1的催化活性驅(qū)動AKT2激活：D-Cl-amidine與體外瓜氨酸化證據(jù)
在HEK293過表達(dá)體系中，PAD1 共轉(zhuǎn)可提升AKT2的磷酸化；而催化失活突變體不能激活 AKT；PAD1抑制劑D-Cl-amidine（D-Cla）在細(xì)胞中劑量依賴性抑制AKT 磷酸化；純化蛋白的體外反應(yīng)（His-AKT2 + rPAD1 + Ca²?）被 anti-Pan-Cit 識別，提示AKT2被直接瓜氨酸化，且該反應(yīng)依賴 Ca²?與PAD1催化活性。在細(xì)胞層面，過表達(dá)WT-PAD1提高p-AKT2的免疫熒光信號，而CS-PAD1無此效應(yīng)；藥理抑制PAD1能降低干性標(biāo)志、抑制成球，并在小鼠移植瘤中抑制腫瘤生長與 AKT2 活性/干性標(biāo)志；與PI3K抑制劑聯(lián)用具有疊加抑制。
Figure 4. PAD1催化的AKT2的瓜氨酸化促進(jìn)OCSLC干性維持
AKT2的R202瓜氨酸化是激酶活性與可磷酸化結(jié)構(gòu)暴露的樞紐
LC-MS/MS 在體外反應(yīng)產(chǎn)物中鑒定到AKT2的R202、R208、R371可被瓜氨酸化（均位于激酶結(jié)構(gòu)域），隨后研究人員構(gòu)建R→E/K/A突變體鑒別功能：R202突變顯著降低AKT2磷酸化，而R208/R371的多數(shù)突變不影響激活。結(jié)構(gòu)建模顯示，僅 R202K 破壞了 S474 與 T309 的表面暴露，為其不能被充分磷酸化提供結(jié)構(gòu)學(xué)解釋。進(jìn)一步，由普健生物提供的位點特異的AKT2-Cit202單克隆抗體，檢測到在體外與細(xì)胞內(nèi)均只在 PAD1依賴下識別到R202瓜氨酸化信號；在多株卵巢癌細(xì)胞中 Cit202 顯著高于 IOSE386；臨床樣本IHC亦顯示腫瘤組織 Cit202 染色增強(qiáng)。
Figure 5. PAD1在R202位點對AKT2的瓜氨酸化促進(jìn)OC細(xì)胞中AKT2酶活性
R202K功能驗證：破壞R202瓜氨酸化可復(fù)制PAD1敲低的“抗干性”表型
在OVCAR3穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)體系中，AKT2-R202K相比WT-AKT2顯著降低AKT2磷酸化、R202瓜氨酸化與干性標(biāo)志表達(dá)；成球與侵襲能力下降；異位移植模型中腹腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)與腹水體積減少；ELDA 證實 CSC 頻率下降；腫瘤組織內(nèi) p-AKT2/干性標(biāo)志同步降低。這些結(jié)果與 PAD1 敲低轉(zhuǎn)錄譜高度重疊，提示R202位點是 PAD1-AKT2 軸維持干性的必要位點。
Figure 6. 在OC細(xì)胞中過表達(dá)AKT2R202K會阻礙OCSLC干細(xì)胞特性的維持
CEBPβ作為PAD1-AKT2的關(guān)鍵效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子
啟動子位點掃描提示CEBPβ與YY1可能共同調(diào)控 SOX2/CD44/CD133/OCT4；ChIP-qPCR證實CEBPβ富集于上述基因的近端啟動子；在PAD1敲低或AKT2-R202K過表達(dá)時，CEBPβ的結(jié)合被顯著削弱；伴隨CEBPβ蛋白下調(diào)與干性基因轉(zhuǎn)錄下降。藥理抑制PAD1或PI3K/AKT可劑量依賴性降低CEBPβ；二者聯(lián)用疊加抑制。在PAD1存在的條件下，R202瓜氨酸化即使在AKT2 S474A失活情況下仍可部分恢復(fù)CEBPβ，提示R202瓜氨酸化除促進(jìn)磷酸化外可能獨立促進(jìn)AKT2保持“有利構(gòu)象/活性”以支持CEBPβ上調(diào)。
Figure 7. CEBPβ可能作為PAD1-AKT2信號通路的關(guān)鍵下游調(diào)控靶點
PAD1 抑制可重塑順鉑耐藥并與AKT抑制劑協(xié)同
研究人員建立OVCAR3-CisR細(xì)胞（5 μM 順鉑維持），顯示干性標(biāo)志升高、球形成增強(qiáng)；并伴隨PAD1上調(diào)、AKT2-R202瓜氨酸化增強(qiáng)、p-AKT與CEBPβ升高，提示 PAD1-AKT2-CEBPβ軸與耐藥同向變化。D-Cla在 CisR 細(xì)胞中劑量/時間依賴地抑制 AKT2 的瓜氨酸化與磷酸化，下調(diào)干性分子并抑制增殖/成球/侵襲。與 AZD5363（AKT 抑制劑）聯(lián)用出現(xiàn)疊加抑制；在裸鼠模型中，CisR 腫瘤對單用順鉑不敏感，但D-Cla + 順鉑可將腫瘤負(fù)荷降低至接近對照組對順鉑的反應(yīng)水平，并在腫瘤組織內(nèi)觀察到 p-AKT2、CEBPβ 與干性標(biāo)志顯著下降，閉環(huán)證明了“抑制 PAD1 → 降低AKT2-R202瓜氨酸化→失活A(yù)KT2/CEBPβ→逆轉(zhuǎn)耐藥”的干預(yù)鏈條。
Figure 8. 抑制PAD1通過抑制AKT2/CEBPB信號通路使OVCAR3-CisR細(xì)胞對順鉑重新敏感
普健生物（AtaGenix）為本研究提供了位點特異的AKT2-Cit202單克隆抗體，在驗證 AKT2-R202的體內(nèi)外瓜氨酸化及其與干性、耐藥的關(guān)聯(lián)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AtaGenix 長期專注于高質(zhì)量蛋白與抗體產(chǎn)品的開發(fā)，提供從抗體發(fā)現(xiàn)、定制開發(fā)到大規(guī)模生產(chǎn)的一站式服務(wù)，助力科研工作者高效推進(jìn)機(jī)制研究與靶點驗證。
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